En
este artículo, haremos una breve introducción acerca de lo que significa
la leishmaniasis como enfermedad; para posteriormente darle
cabida a la Histotecnología en el proceso de detección de la misma, a través de
técnicas histoquímicas muy poco habituales, las cuales son aplicables en este
artículo en particular, a biopsias mucocutaneas específicamente de áreas
nasales.
En este sentido comenzamos por definir así la Leishmaniasis:
La
leishmaniasis constituye
un espectro de enfermedades causadas por especies del protozoo flagelado Leishmania, el cual ha de ser
intracelular obligado en humanos y otros mamíferos, este produce lesiones a
niveles cutáneo, mucocutáneo y visceral.
Se
transmite a los humanos por la picadura de flebótomos hembra infectados. En
América, el vector es el mosquito Lutzomyia, y en Europa, el género
Phlebotomus.
Se
conocen más de 90 especies diferentes de flebotomianos transmisores de Leishmania.
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Flebótomo hembra
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De
acuerdo a su morfología
El
Leishmania; es un protozoo
intracelular obligado dimórfico (adopta dos formar). En los hospederos
mamíferos, se localiza en los macrófagos y células dendríticas (células de
Langerhans en la piel).
El promastigote (metacíclico)
Es
la forma infectiva, de carácter elongado y se encuentra extracelularmente, se
desarrolla y se multiplica en el tracto digestivo de los insectos transmisores,
pertene además al género Lutzomyia en América y Phlebotomus en el Viejo Mundo.
Mide de 10 a 20 µm (micras), sin contar la longitud del flagelo, cuyo tamaño
oscila entre 15 - 25 µm; presenta un gran núcleo central, ribosomas, retículo
endoplásmico, aparato de Golgi, vesículas y una mitocondria. El cinetoplasto (Masa
de ADN circular extranuclear ubicado en la mitocondria) aparece como una banda
granular electrodensa dentro de la extensión de la mitocondria, localizado a 1
- 2 µm del extremo anterior del parásito, de donde emerge el flagelo. El
axonema que se origina en el cuerpo basal está contenido dentro del bolsillo flagelar.
Promastigote Giemsa
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Promastigotes Giemsa
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Promastigotes en cultivo
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El amastigote
Es
la forma replicativa, redondo u oval, intracelular, reside y se multiplica en
los fagolisosomas dentro de los fagocitos mononucleares (Macrofagos) de los
hospederos, aunque se ha documentado la presencia de amastigotes en neutrófilos
y fibroblastos en lesiones de piel. (Laskay T, et al. 2003). Mide de 2 a 4 µm;
y con la tinción de Giemsa se aprecia un gran núcleo y un cinetoplasto pequeño,
ambos de color púrpura, y un filamento delgado que une cinetoplasto y cuerpo
basal, éste último apenas un punto visible.
El
cinetoplasto es una subestructura de la mitocondria, con DNA único y se
encuentra asociado estrechamente al bolsillo flagelar y al cuerpo basal del
flagelo. La presencia del cinetoplasto da el nombre al grupo de protozoos
incluidos en el orden Kinetoplastida.
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Macrófago Infectado
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Macrófago infectado con amastigotes
de Leishmania. La fotografía se tomó
de una impronta de Leishmania tomado del acervo del laboratorio de Leishmania, teñida con Giemsa. La
fotografía fue tomada a 100 aumentos. Las características que se observan de
los amastigotes son que presentan forma ovoide o esférico, no presenta el
flagelo y tienen un tamaño de 3 µm x 5
µm. La flecha número 1 indica la presencia de macrófago, 2 núcleo de macrófago,
3 amastigote, 4 fagolisosoma, 5 cinetoplasto y el número 6 el núcleo de
amastigote.
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De acuerdo al ciclo de vida del protozoo
Los
promastigotes metacíclicos, extracelulares, una vez en la probóscide del
mosquito hembra, también conocido como "mosca de arena", son
introducidos en la piel de un hospedero vertebrado durante la ingesta de
sangre. Los parásitos son fagocitados en piel por macrófagos, células de Langerhans
y activan el complemento. Aunque muchos promastigotes son destruidos por los
polimorfonucleares, algunos se transforman en amastigotes en las células del
sistema fagocítico mononuclear; en los fagolisosomas (vacuola parasitófora),
pierden el flagelo y se transforman en amastigotes, multiplicandose por
división binaria. La replicación ocurre en cantidades que oscilan desde decenas
hasta cientos. Las células infectadas se rompen finalmente y los amastigotes se
diseminan, de acuerdo a factores del parásito y del hospedero, entre otros,
hacia diferentes tejidos. Cuando moscas libres de infección se alimentan de
individuos infectados, ingieren las células con amastigotes que sufren cambios
bioquímicos y morfológicos en el intestino medio del insecto, se multiplican y finalmente
migran a la probóscide como promastigotes metacíclicos, altamente infectantes y
promastigotes.
La leishmaniasis
y sus diversas formas de expresión
La
leishmania puede presentarse de tres formas diferentes
tales como:
1- Leishmaniasis
visceral o Kala
Azar:
La
infección puede ser asintomática, aguda o crónica.
En
países en desarrollo, los niños con algún grado de desnutrición y los sujetos
HIV positivos son la población en mayor riesgo de adquirir la enfermedad
progresiva.
El
tiempo de incubación es de meses, a veces años y la aparición de signos y
síntomas es habitualmente insidioso, y en ocasiones, en el sitio de la agresión
se desarrolla un nódulo, permanente, como único signo inicial. Los cuadros
agudos son menos frecuentes.
Cuando
se manifiesta la enfermedad, es grave, y la mortalidad sin tratamiento es del
100%. Las características generales de la enfermedad han de ser fiebre
irregular, pérdida de peso, hepatoesplenomegalia y anemia. Es altamente
endémica en el subcontinente indio y África Oriental. Se estima que cada año se
producen en el mundo entre 200.000 y 400.000 nuevos casos de este tipo y más
del 90% se concentra en 6 países: Bangladesh, Brasil, Etiopía, India, Sudán y
Sudán del Sur.
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| Hepatoesplenomegalia. WHO/TDR/Desjeux |
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Síndrome de desgaste. WHO/TDR/Crump |
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2-ishmaniasis cutánea (L.C) o Post-Kala Azar: Es
la forma más frecuente de Leishmaniasis , y las lesiones son de carácter ulcerosas
y se producen en las áreas corporales expuestas (cara, tronco, extremidades),
que dejan cicatrices de por vida y son causa de discapacidad grave. Esta puede
ser local o diseminada, la prevalencia de una u otra forma de leishmania cutánea ha de depender del sistema inmunitario
del hospedero; ya que en personas inmunocomprometida la enfermedad se disemina
por todo el tegumento, mientras que en aquellas que se mantienen
inmunocompetentes, pueden contener la misma en la zona de inoculación. La
úlcera característica es redondeada, de borde elevado y bien definido,
indurado, cubierta por una costra amarillenta; cuando ésta se desprende revela
un fondo de tejido de granulación limpio. Aproximadamente un 95% de los casos
de L.C se producen en las Américas, Cuenca del Mediterráneo, Oriente Medio y Asia
Central. Más de las terceras partes de los nuevos casos aparecen en 6 países:
Afganistán, Argelia, Brasil, Colombia, República Islámica de Irán y República
Árabe Siria. Se calcula que cada año se producen en el mundo 0,7 y 1,3 millones
de nuevos casos.
3-Leishmaniasis
muco-cutánea:
Conduce a la destrucción parcial o
completa de las membranas mucosas de la nariz, la boca y la garganta. Las
manifestaciones clínicas se presentan muchos meses o años después de haberse
resuelto la enfermedad cutánea; se debe a metástasis de lesiones cutáneas,
aunque en un porcentaje de los casos no es posible identificar la lesión
primaria.
Las lesiones se inician principalmente en
mucosa nasal, simulando en el inicio una rinitis. Se aprecia inflamación de la
mucosa e hipertrofia vascular, con ulceración posterior que llega a comprometer
el tabique nasal cartilaginoso. Aproximadamente un 90% de los casos de Leishmaniasis muco-cutánea se producen en Brasil, el Estado
plurinacional de Bolivia y Perú. Como las provincias del Norte y Noreste de la
República Argentina limitan con estos países en estas zonas suele, también,
considerarse endémica aún cuando la O.M.S no lo mencione en sus informes; ya
que es habitual que los habitantes de ambos lados de la frontera crucen hacia
uno u otro lado. De allí que, exista un número elevado de casos en nuestro
país.
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LMC. Lesión conocida como
"nariz de tapir". CDC/ Dr. Mae Melvin
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Transmisión
De
acuerdo a la forma en la que esta enfermedad es contraída por el ser humano, podemos
decir que la forma infectiva, el promastigote metacíclico, es inoculado a
través de la picadura de dípteros del género Lutzomyia, en América, y
constituye el principal mecanismo de transmisión. Estos insectos pueden
adquirir la infección de humanos y reservorios tales como roedores, cánidos y
primates. La transmisión entre humanos puede ocurrir por contacto con material
de una lesión, transplante de órganos, transfusión sanguínea y a través de la
placenta.
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Flebótomo Hembra
Los
flebotóminos transmisores son pequeños, miden 1.5 - 2.5 mm y están cubiertos de
pelos. Se cree que un 10% de las 600 especies conocidas está involucrado en la
transmisión de la leishmaniosis humana. La hembra requiere de sangre para la
maduración de los huevos, entre tanto que los machos se alimentan de jugos de
frutas. Sustancias presentes en la saliva, como la maxaladina, se han
relacionado en parte con el tropismo de los aislados de Leishmania.
Por otra parte, con relación al diagnóstico:
El
diagnóstico de la Leishmaniasis visceral se realiza mediante la combinación de
un examen clínico con pruebas parasitológicas o serológicas (pruebas de
diagnóstico rápido u otras). Las pruebas serológicas tienen un valor limitado
en las Lieshmaniasis cutánea y muco-cutánea.
Sumado
esto al alto costo que representarían para el nivel hospitalario que suele
encontrarse en esas zonas es que muchas veces se recurre a la técnica de Giemsa
para demostrar la presencia del protozoo que no siempre suele dar el resultado
esperado.
La
observación directa de Leishmania por tinción con Giemsa, se utiliza para teñir
el aspirado de la médula ósea, impresiones de las lesiones o biopsias obtenidas
de pacientes que presentan sospecha de leishmaniosis en sus diferentes formas
clínicas (leishmaniosis cutánea localizada (LCL), leishmaniosis visceral (LV),
leishmaniosis mucocutánea (LMC) y leishmaniosis cutánea diseminada (LCD). Esta
técnica es considerada como la de mayor eficacia y confiabilidad ya que se
observan directamente a los amastigotes causantes de la enfermedad.
Sin
embargo, en el presente artículo, no hablaremos de la técnica de Giemsa en
particular, sino de un método muy útil para confirmar el diagnóstico, el cual
es poco conocido pero que resulta muy eficaz y práctico; ya que este puede ser
realizado con reactivos con los que habitualmente contamos en los laboratorios
de Anatomía Patológica.
Como
se mencionó anteriormente, en las regiones Norte y Noreste de Argentina; es una
enfermedad endémica y en esta oportunidad, además de compartir con ustedes la técnica;
publicaré fotos que tomamos del resultado de la misma, que se obtuvieron de una
muestra mucocutánea de un paciente que llegó al Hospital de Agudos Dr. Cosme
Argerich, el cual es dependiente del Ministerio de Salud del Gobierno de la
Ciudad Autónoma de Buenos Aires (Argentina) proveniente de la Provincia de
Misiones (que limita con la República Federativa del Brasil); la clínica y el
aspecto que presentaba la lesión en la nariz del paciente era sospechosa de la
presencia del protozoo.
En
el corte de rutina coloreado con hematoxilina-eosina se observaban estructuras
sospechosas; no compatibles con la histología normal, y en ese sentido, se
solicitó entonces una coloración de Giemsa para evidenciar dicho protozoo de
mejor manera, mas sin embargo esta no fue concluyente.
Por
ello, se me consulto, si conocía de alguna otra técnica especial con la cual pudiésemos
llegar al diagnóstico; y recordé que hacía algún tiempo el Histotecnólogo Don
Julio Happa (Mi ex jefe en el Hospital Británico de Buenos Aires y uno de los Histotecnólogos
de más prestigio en el país y en Estados Unidos quien ha trabajado, junto al
Doctor Rosai y al Doctor Lascano, entre otros) había compartido conmigo,
un material para evidenciar a este tipo
de protozoario en particular, que le había sido entregado por parte de un
colega que realizaba sus tareas en la Provincia de Salta (también zona endémica
de Leishmaniasis ). Y Fue entonces gracias a esta técnica,
que se obtuvo el resultado para diagnosticar aquella lesión…
MÉTODO
GALLEGO PARA LEISHMANIASIS
SOLUCIONES:
1- Solución de Zielh 20 gotas
Agua
destilada 10 c.c
2- Agua
destilada 10 c.c
Ácido acético glacial 3 gotas
Formol
40% 3 gotas
(Mordiente
y a la vez Diferenciador)
3- Índigo carmín 0,25 gramos
Ácido
pícrico saturado 100 c.c
4- Agua
destilada 10 c.c
Ácido acético glacial 3 gotas
Las
soluciones 1,2 y 4 se preparan al momento de usar.
MODO
DE EMPLEO:
1- Desparafinar
e hidratar
2- Cubrir
el corte con solución (1) por 5 minutos.
3- Lavado
rápido con agua destilada
4- Hacer
actuar la solución (2) hasta que el corte tome color violeta.
5- Lavar
con agua destilada
6- Cubrir
con solución (3) por 1 minuto
7- Sin
enjuagar pasar a solución (4) hasta que tome tinte azulado (entre 20 a 30
minutos)
8- Lavar
con agua destilada
9- Deshidratar,
aclarar y montar
RESULTADOS:
Tejido en general:
Núcleos: Magenta (Fucsina básica
implicada)
Citoplasma: Amarillo (Ácido pícrico
implicado)
Fibras colágenas: Azules (Índigo Carmín)
Fibras Elásticas: Violeta (Índigo Carmín +
Fucsina Básica implicados)
Musculo: Verde (Índigo carmín + Ácido
Pícrico)
Estructuras del Protozoario:
Núcleo: Magenta (Fucsina Básica implicada)
Citoplasma: Azul y Amarillo (Índigo Carmín
+ Ácido Pícrico implicados)
Nota:
El protozoario se ha de observar de marrón oscuro. En vista de que por su pequeñez,
a nivel visual, se han de unir los tres colores Magenta + Azul + Amarillo dando
como resultado un color marrón oscuro.
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Técnica de hematoxilia-eosina
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| Técnica de Hematoxilina-eosina (A mayor aumento más evidente se hace la presencia de estructuras no compatibles con las estructuras celulares normales |
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Método Gallego aplicado a Lesión
Muco-Cutánea
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Método Gallego aplicado a Lesión
Muco-Cutánea
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Método Gallego (A mayor aumento se
observa claramente como el protozoo de la Leishmania
ha sido teñido de marrón oscuro)
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Protozoarios: Marrón Oscuro, Café.
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Esperamos
que la técnica anteriormente presentada les resulte interesante y de gran
utilidad y que puedan además utilizarla en los casos donde la tinción habitual
de Giemsa no deja claramente en evidencia la presencia y morfología del
parásito.
Nota:
Las
imágenes histopatológicas de este caso; fueron presentado en poster por Residentes de los Servicios
de Dermatología y de Anatomía Patológica en los Congresos Anuales
correspondientes a las mencionadas especialidades.
Autor:
HT.
Mercedes Salayeta
Redacción
de Contenido:
Lcdo.
Daniel Abrams
Referencias
Bibliográficas:
[http://www.indre.salud.gob.mx/interior/lab_leishmania .html]
[http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/leishmaniosis.html]
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